分子クローニングプロトコル

分子クローニングプロトコールは、DNA配列を定義、単離および複製するために使用される手順を包含する。
従来の制限およびライゲーションクローニングプロトコールは、制限エンドヌクレアーゼ（制限部位でDNA鎖を切断する酵素）、DNA断片ライゲーション（DNA分子における不連続性の修復）、トランスフェクション（細胞体への核酸の導入）および選択（複製のための個々のゲノムの選択）。分離

分子クローニングの第一段階であるDNA断片の単離のためのプロトコールは、しばしばDNAの断片を増幅するために加熱と冷却のサイクルを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PMR）を組み込んでいます。
標的配列の大きさに達するために、他のプロトコールには、DNA超音波処理、反応酵素消化および化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの使用が含まれる。これらのプロトコールは、必要とされる単離されたDNAの量および量に依存して変化する。ライゲーションのためのプロトコールは、酵素、DNAリガーゼを用いて、共有結合。プロトコルは、DNA断片、クローニングベクター、ライゲーションバッファー、DNAリガーゼ、および微量遠心管内の滅菌水を混合し、4℃で一晩インキュベートすることを指示する。
トランスフェクション

トランスフェクションのためのプロトコール、または非ウイルス手段を用いて細胞にDNAを注入するためのプロトコールは、しばしば細胞質に直接DNAを注入することを伴う。他の方法には、細胞膜を介してトランスフェクション複合体を送達するために、リン酸カルシウムおよび脂質などの化学試薬を使用することが含まれる。この方法は、特定の遺伝子の機能に対する遺伝子修飾の影響を試験する。

選択またはスクリーニングプロトコルは、どの細胞が正常にDNA挿入物を保持し、どの細胞が単離を必要とするか。
遠心分離機はトランスフェクションされたDNAを含む細胞を採取し、リゾチーム（天然酵素）緩衝液中でインキュベートし、アルカリ性界面活性剤で処理してタンパク質と膜を溶解させる。アセテートを用いてタンパク質を沈殿させ、遠心分離し、チーズクロスしてDNA含有上清（遠心分離した化合物から残った可溶性液体）をろ過する。上清をポリエチレングリコールで沈殿させ、遠心分離し、塩化セシウムおよび臭化エチジウム緩衝液に懸濁させる。エチジウムブロマイドは密度に応じてDNAを染色し、長波長UV光を使用して、下部バンドDNAを5ccのシリンジで抽出する。
平衡化されたイオン交換カラムは、臭化エチジウムおよび塩化セシウムからDNAを分離し、最終DNAペレットを緩衝液に懸濁させ、アガロースゲル電気泳動で検出する。