核酸のテスト方法

核酸の検査は、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）を検出するために、医学的診断において実施される。
これらの検査ははるかに迅速であり、したがって、医師は、通常より長時間の退屈な抗体ベースのアッセイを使用して感染の確認を待たなければならない患者の治療を開始することができる。この方法は、核酸増幅試験としても知られており、「逆転写酵素増幅」として知られている方法を含む。ポリメラーゼ連鎖反応による。これは高度に専門化された科学的手順であるため、分子生物学の技術と理論の高度な知識と専門知識が必要です。
PCRチューブ
PCRサイクラー
ピペットとフィルターチップ
手袋と細胞
Trizolまたは他のRNA抽出試薬
PCRバッファーとTaqポリメラーゼ< 1mg /ml濃度のRNaseフリー水中でのbr> RT-PCRプライマー
dNTPs-MgCl2
1.8mg /ml濃度のランダムプライマーSuperScript II逆転写酵素

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RNAの処理と準備


<1> TrizolなどのRNA抽出試薬で細胞を収穫します。
6ウェル組織培養プレートの1つのウェルから細胞を回収するのに十分である。細胞を完全にピペットで上下に均質化し、Trizolデータシートに記載されているように抽出手順を実行します。簡単に説明すると、クロロホルムで抽出した後、遠心分離してDNA、タンパク質およびRNAの相を分離する。無色のRNA相のみを回収し、イソプロパノールで沈殿させる。インキュベーション後、それを遠心分離し、得られたペレットをいくつかのエタノール洗浄で浄化する。次に、ペレットをRNaseフリーの水に再懸濁します。


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逆転写のために、10マイクロリットル（ul）のRNaseフリー水で65℃で正確に5マイクログラムのRNAを変性させ、氷上に置く。各反応について、10μlのRNA、3μlの10×PCR反応緩衝液、2.5μlの10mMのdNTP、6μlの25mMの塩化マグネシウム、1μlの1.8mg /mlのランダムプライマーのプライマー、および0.5μlのSuperScript II逆転写酵素である。 17ulのRNaseフリー水で各反応を補充する。チューブを室温で10分間、次に42℃で1時間インキュベートしてcDNAを生成し、次いで95℃で変性させてすぐに氷で反応を停止させる。


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ポリメラーゼ連鎖反応のために、逆転写反応で作製した6μlのcDNA、10μlのPCR反応緩衝液1.5μl、Taqポリメラーゼ0.2μl、逆方向プライマー0.5μlおよび次に、10.3ulのRNaseフリー水で各チューブを蓋をする。反応を実行するために、以下のように30サイクルのサーマルサイクラー（すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応を行う機械）を設定する：95℃で0.5分間変性させ、続いて60℃で45秒間アニーリングし、最後に72℃摂氏1分、合成転写物を伸ばす。