編集：病気
冷リン酸で研究中の細胞または組織を洗浄するバッファード生理食塩水、PBS。
混合物をドライアイス上に20分間、次いで室温で10分間置くことによって、抽出緩衝液中で細胞を抽出するかまたは組織を分解する。繰り返す。
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10秒間ボルテックスする。細胞または組織の破片をペレットにするために遠心分離機で5分間回転させる。上清を除去し、液相を取り出し、きれいなチューブに入れます。
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特殊フィルターで上清をろ過し、NADHを分解する酵素を除去します。
200マイクロリットルを取り出し、きれいなチューブに入れ、加熱ブロックで60℃で30分間加熱してNADを変性させます。冷やして遠心分離し、液相を除去する。
96ウェルプレートに50マイクロリットルを移す。各サンプルは二重または三重でなければならない。総NAD、NADtを決定するには加熱しないでください。
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96ウェルプレートにサイクリングミックスを準備して加えます。混合し、5分間インキュベートする。 10マイクロリットルの現像液を加え、室温で4時間までインキュベートする。停止溶液を加える。キットに応じてプレートリーダーまたは蛍光光度計で色の変化を読み取る
標準曲線と計算
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既知の濃度のNADHを取り、それを希釈して標準曲線を作成する抽出バッファー中で。
異なる濃度に希釈して、エンドボリュームがテストサンプルと同じになるようにします。試験サンプルと同じ96ウェルプレート上のプレート。光学濃度を読み取ります。
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X軸に濃度、Y軸に光学濃度を持つ標準曲線グラフを描きます。各試験サンプルの平均をとって標準曲線グラフから濃度を読み取る。
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NAD /NADH比を、NADHからNAD、NADtを差し引いて計算し、次にNADHで除する。
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