細胞表面ビオチン化プロトコル

ビオチン化は、可溶性ビタミンビオチンが細胞タンパク質に結合する能力を利用する。
ビオチンは、タンパク質のストレプトアビジンに結合し、したがって、細胞タンパク質を視覚化するために細胞生物学において有用である。ビオチン化は、放射能などの技術と比較してタンパク質の安全な標識を可能にし、細胞の正常な機能に影響しない。研究者は受容体などの細胞タンパク質を研究することができ、疾患や病気のプロセスをより深く理解することができます。浮遊細胞の標識

細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄して、汚染物質を除去する。トリスとグリシンを含むバッファーはビオチン化と競合し、避けるべきである。
内部タンパク質のビオチン化を避けるために、標識は4℃またはアジドの存在下で行うことができる。 PBSおよび可溶性ビオチン、スルホNHS-LC-ビオチン中の細胞を再懸濁する。


接着細胞の標識化

細胞をPBS中で洗浄し、スルホ-NHS-LC-ビオチン。次に細胞を皿に掻き取り、界面活性剤Triton-X100を含有する緩衝液中で溶解し、視覚化のために調製する。


標識細胞の調製

細胞を遠心分離してペレットにし、PBSで洗浄する。細胞をPBSに再懸濁し、IgGセファロースゲルで精製する。
結合タンパク質をローディングバッファーで希釈し、100℃に加熱する


細胞を可視化する

希釈したタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE）し、続いてタンパク質および酵素混合物であるストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシドでブロッティングした。ブロットは、化学反応---化学発光---光を放射する可視化されています。ビオチン化の特異性は、研究中のタンパク質の抗体で確認することができます。